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2 Material und Methoden

und 1 ml der Zellsuspension wurde in 6 ml DMEM in einer 25 cm

Zellkulturflasche

kultiviert.

2.4.1.3 Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung

Die Zellzahl wurde mit einem Hämozytometer nach Neubauer bestimmt. Das Raster der

Zählkammer ist in neun Quadrate unterteilt, wobei sich in den vier Ecken Flächen zum

Auszählen befinden. Diese vier Eckquadrate sind wiederum in 16 kleinere Quadrate unterteilt

und haben je eine Fläche von 1 mm

Vor der Zellzahlbestimmung wurden die Zellen wie bei der Kultivierung, a/jointfilesconvert/443964/bgelöst und

abzentrifugiert und anschließend in frischem DMEM-Medium aufgenommen.

Um die Vitalität der Zellen zu bestimmen, wurden 10 µl Zellsuspension mit 10 µl

Trypanblau-Lösung vermischt und auf die Zellkammer aufgebracht. A/jointfilesconvert/443964/bgestorbene Zellen

haben eine veränderte Membrandurchlässigkeit, dadurch dringt das Trypanblau in die Zellen

ein, während gesunde Zellen ungefärbt bleiben.

Pro Ansatz wurden mindestens 100 Zellen gezählt, je nach Zellzahl wurden bis zu vier

Eckquadrate gezählt. Die Zellzahl / ml wurde wie folgt berechnet:

Formel:

Zellen

/ N

Quadrate

) x 2 (Verdünnung) x 10

= Zellen / ml

2.4.1.4 Transfektion von Zellen

Die Transfektion dient der Einschleusung heterologer DNA in Eukaryontenzellen. Die

verwendeten Methoden wurden zur transienten Transfektion eingesetzt. Transiente

Transfektion bedeutet kurzfristiges Einbringen von DNA in viele Zellen. Dadurch ist eine

schnelle funktionelle Untersuchung innerhalb von ein bis drei Tagen möglich.

Zur Transfektion von Zellen wurden in dieser Arbeit zwei unterschiedliche Ansätze

verwendet.

a) ExGen-Methode (nach Fermentas)

Das Makromolekül-Reagenz Polyethylenimin (PEI), das eine kationische Ladungsdichte

besitzt, reagiert mit der DNA zu einem starken diffusionsfähigen Komplex, der leicht über

Endozytose in die Zelle aufgenommen wird.

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